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CRISPR会不会是可以修正遗传疾病基因变异的涂改液呢？

八月初，Nature刊登了一篇长篇论文，标题简单明确，一刊上网就毫不费力的吸引了众人焦点。到底是什么研究这么厉害？美国科学家在人类胚胎细胞上成功利用CRISPR技术，将遗传性肥厚型心肌症的基因变异“矫正”回正常序列。但研究结果一刊登，引起的哗然与质疑也始料未及。这个好结果到底是成功了，还是只是美丽的误会一场呢？

美国 Oregon Health &； Science University 研究中心的 Mitalipov 博士实验室，在人类胚胎上，成功把导致遗传疾病的基因变异序列，修正回正常序列了！Mitalipov 实验室所使用的，就是响当当的 CRISPR 与 Cas9 新技术。

对于遗传性疾病，如果可以在发生变异的基因序列上，直接将基因突变修复回正常序列，是最一劳永逸的方法。随着CRISPR/Cas9 技术的成熟，这想法也不再遥远如天边浮云；相较传统基因编辑的方法，CRISPR/Cas9 便宜、快速又精准。在极短时间内，CRISPR/Cas9 风靡了整个科学界。CRISPR/Cas9 可以想象成是装了 GPS、专门针对 DNA 的爱德华剪刀手。

Cas9 蛋白的真实身份是DNA 核酸内切酶，能够在 DNA 双链上大剪刀一咖嚓，让 DNA 双股断裂。而能为 Cas9 剪刀手充当导航仪的 CRISPR，是一段写了目标 DNA 在哪里的序列。当 CRISPR 被转录为成熟的 CRISPR RNA（crRNA）之后，会跟 Cas9 装在一起，然后看哪一段 DNA 跟 crRNA 的序列长得一样，紧紧跟对应的 DNA 那股结合。当 crRNA 结合上 DNA 之后，会让 DNA 双股分离，Cas9 于是能够将 DNA 剪断。双股断裂的 DNA 在细胞内是火山爆发等级的紧急事件，细胞会启动修复机制，尝试把 DNA 复原回原来的样貌。而这于是开了一道门，让科学家有机会利用细胞修复 DNA 的时候，用点小伎俩让 DNA 被修改为“想要的样子”。例如：将遗传疾病的突变序列，修复为正常序列。而这也是美国 Mitalipov 博士实验室想要尝试的事。

这次，Mitalipov 实验室挑定了遗传性肥厚型心肌症（hypertrophic cardiomyopathy）。肥厚型心肌症是造成运动员猝死的主要原因之一，临床上症状是心脏衰竭。但也因为病发时间较晚，所以致病基因容易传到下一代。遗传性肥厚型心肌症是显性遗传，大约每五百个成人里，就可能有一人罹患遗传性肥厚型心肌症。目前对于此病，多半是针对症状治疗。唯一能从病根下药的方法，是利用体外人工受精技术，在胚胎植入前再用遗传学基因诊断，把没有遗传到基因变异的正常胚胎筛选出来。Mitalipov 实验室想要利用 CRISPR/Cas9 来提供另一个对症下药的方法。借由 CRISPR/Cas9 引起胚胎细胞内 DNA 双股断裂，让细胞启动能重组修复机制，然后一举将变异基因修改掉。

在细胞株、老鼠、猴子身上，利用 CRISPR/Cas9 技术修改基因序列已是屡见不鲜，我们也学到了许多关于 CRISPR/Cas9 的黑暗面。已知的困扰主要是三大难处：其一，是 crRNA 找到目标 DNA 的精确度，也就是所谓的脱靶效应（off-target effect）。因为 crRNA 通常是长约 20 个碱基对的序列，就像我们偶尔会在路上认错人一样，科学家也一直担心 crRNA 会不会认错目标 DNA。认错人可以道歉就了事，但 crRNA 一但指鹿为马，让 Cas9 在无辜的 DNA 序列上大剪刀一挥，就真得是愈帮愈忙了。

其二，CRISPR/Cas9 再精准、效率再高，也不会是百分之百。而也因为这个难处，导致第三个麻烦。通常用 CRISPR/Cas9 技术所得到的基因转殖老鼠，第一个子代都还没有办法直接拿来做实验，要让基因转殖老鼠再跟没被改造的正常老鼠交配繁殖一代。这是因为通常把 CRISPR/Cas9 送进老鼠胚胎细胞的时候，老鼠胚胎可能已经是发育成两个细胞以上的多细胞状态。因此，每个细胞被“改造”后的基因序列可能都不太一样，让最后的个体像是万花筒一样，会有不只一种的基因序列。

那 Mitalipov 怎么解决这些问题呢？

参与实验的是名成年男性，有肥厚型心肌症的家族遗传病史，肇因是 MYBPC3 其中一股DNA上的序列，少了四个碱基对（另一股序列正常），以至于蛋白质失去功能。MYBPC3基因负责表达心肌肌球蛋白结合蛋白C3；这蛋白可不简单，在心肌细胞讯息传导路径上扮演着重要角色。不仅维持了心肌结构，更能调节心肌收缩与舒张的功能。Mitalipov 实验室采样了受试者的皮肤细胞、血液、与精细胞。皮肤细胞可以被培养成诱导多功能干细胞（induced pluripotent stem cells），提供了另一个绝佳的实验角度。

研究人员发现，注射 CRISPR/Cas9 到胚胎细胞的时间点很重要。他们刚开始的时候，在卵细胞受精之后的 18 小时注射CRISPR/Cas9、以及一小片段的 DNA 模板，让细胞能够一样画葫芦的按照模板上的序列修改基因突变。三天后，当受精卵分裂为四到八个细胞的囊胚细胞期，研究人员再取出来分析。控制组的胚胎细胞，正常与带有基因变异的机率如预期，各是一半一半（因为受试者两个对偶基因，一个正常，一个突变）。但注射 CRISPR/Cas9 与 DNA 模板的实验组，正常胚胎比率增加到 66%。但科学家所烦恼的梦魇三也成真，有四分之一的胚胎细胞镶嵌了许多不同的突变。

后来，当研究人员采取另一个策略，在注射精细胞的时候，连同 CRISPR/Cas9 与 DNA 模板，一起注射到停留于第二次减数分裂中期的卵细胞（metaphase II-stage oocytes），三天后再分析胚胎细胞。这时候，有高达七成的胚胎细胞都是正常，而且其他的胚胎细胞，没有发现镶嵌不同突变的问题。而且，他们定序了几个经程式预测，可能是脱靶效应高危险群的基因，也都没有被 CRISPR/Cas9 乱枪打鸟而波及的迹象。

乍看之下，只要注射 CRISPR/Cas9 的时间拿捏得好，编辑基因来修复导致遗传疾病的基因突变，不是不可行。但 Mitalipov 的实验结果有一点很出乎意料，这也成了他们研究结果中，惹人皱眉抓不头也想不懂的事。

记得他们在注射 CRISPR/Cas9 的时候，也夹带了一段 DNA 模板，让细胞在进行 DNA 序列修复的时候可以参照吗？在那段模板里，他们更改了 DNA 序列，让制造出来的蛋白质跟正常蛋白质虽然一模一样，但可以跟人类基因序列有所区隔。他们所分析的所有胚胎细胞，没有一个用了他们的模板，反而是用了来自卵细胞的 DNA 序列。但他们同时在由病人皮肤细胞所培养出来的诱导多功能干细胞实验里，却几乎都使用了挟带的、更改过的 DNA 为作为修复模板。

Mitalipov 实验室怀疑这可能是人类受精卵有不同于一般细胞的基因修复机制。但其他基因学家，却担心这也可能是 Mitalipov 实验室的分析出了问题，以至于实验成功只是一场美丽的误会。许多基因学家考量的点在于，在精卵受精后，各自的 DNA 要等到约一天之后才会有可能近距离碰在一起。如果在这之前，卵细胞的 DNA 和精细胞的 DNA 都无法碰头，那来自精细胞 DNA 的基因变异，要如何能够利用卵细胞 DNA 上的正常序列来当作模板，进行基因修复呢？

Mitalipov 的实验成功，或许跨出了利用基因编辑技术来治疗遗传性疾病的第一步，但实验结果也有许多的眉角需要更多的脑力激荡，被提出的质疑也需要好好讨论。但不论如何，后续发展还是很令人期待的！

参考资料：

Chandrasegaran S， et al. Genome editing of human embryos: to edit or not to edit， that is the question. J Clin Invest. 2017 Aug 28. pii: 96962. doi: 10.1172/JCI96962. PMID: 28846073

Winblad N， et al. Biotechnology: At the heart of gene edits in human embryos. Nature. 2017 Aug 24；548（7668）:398-400. doi: 10.1038/nature23533. Epub 2017 Aug 2.