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基础仪器定位纳米世界

图/显微观点

电脑运算是近 20 年来生物影像突破绕射极限的可靠工具，例如 STORM（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy）, PALM（Photo-Activated Localization Microscopy），以电脑记忆、叠合，将多次拍摄的零散萤光重建成完整舆图，解析度极限可接近 10 纳米。

现在，透过电脑辅助的序列成像解析度增强术（RESI, Resolution Enhancement by Sequential Imaging），科学家能将细胞内分子的定位解析度大幅提升到埃（Ångström, Å.等于1/10纳米）的尺度，清晰定位紧邻的分子、观察它们在细胞内的变化。

RESI 定位可呈现 DNA 相邻碱基间距，超越超解析显微镜，达到与电子显微镜同等的解析度，而且只需基本的细胞固定，近乎完全保持样本原貌。

在德国马克斯.普朗克生化研究所率领团队研发 RESI 的荣曼（Ralf Jungmann）认为，RESI 能填补介于光学显微术与结构生物学之间的资讯空白，揭露更多复杂生命系统的真相，为分子生物学与药物动力学开辟道路。

“发光顺序”成为解析度新要素

使 RESI 成为“超级超解析”定位术（super-super resolution）的核心概念，是以不同 DNA 萤光探针对目标进行多次标记定位，定位过程由电脑为目标编上号码（DNA-barcoding），使“发光顺序”成为分辨目标的新维度，并以“定位次数”来大幅提升解析度、为量化分析提供充沛样本。

CD20 的分布在 RESI 定位下一览无遗，透过 RESI 定位可发现，标靶药物 RTX 使癌细胞表面的 CD20 聚集成链状。图片来源：Reinhardt et al. Ångström-resolution fluorescence microscopy. Nature 617, 711–716 （2023）.

例如，淋巴癌与自体免疫疾病的关键标靶：B 细胞表面 CD20 蛋白﹐虽然早已发现是重要的癌细胞特征，也确认有效药物，但其结构与分子动力学依然暧昧不明，学界对它的了解还不足以研发进一步疗法。

尽管 CD20 蛋白的结构已被电子显微镜呈现，但电子显微镜的拍摄条件会破坏细胞膜结构，导致 CD20 变形、偏移。现在透过 RESI 进行定位，CD20 的构造、药物效果，都可以在接近生理状态下一探究竟。

在 RES I分析下，荣曼等学者发现 CD20 总是成对出现（as dimers），并且在关键药物 RTX（一种抗 B 细胞的单株抗体）加入后，会在细胞膜上聚集成紧密的长链。这些资讯是过往电子显微镜与超解析光学显微镜都未曾展现的。

序列成像：以次序换取空间

各种超解析单分子定位术的共同难题，是两个目标分子过于接近，连电脑运算也无法辨别。假使两个距离 1 至 2 纳米的相同分子轮流被激发，PALM, STORM 等仰赖随机放光的超解析定位术即使分别收到两个光源的萤光讯号，重建时也容易将紧密的两者混为一点。

荣曼也强调，当两个萤光团的距离小于 10 纳米，近场光学效应会大幅影响光调控萤光染色分子（photoswitchable fluorescent dyes）的表现。分辨两个距离数纳米甚至数埃（Å）的分子，是单分子定位技术的最后关卡。

面对诺贝尔级超解析技术也无法克服的障碍，RESI 巧妙地以“标记”技术避开了光学难关。RESI 采用进化版本的 DNA-PAINT，萤光探针与目标结合转瞬即脱落，并能使相邻的目标结合不同探针，避免两者同时发光，两个紧密的分子几乎不会干扰彼此成像。

奠基于随机放光的单分子定位术（SMLM），序列成像（Sequential Imaging）用不同颜色、不同激发光谱的 DNA 萤光探针，标记邻近的两个目标，使两者轮流发光。如此一来，发光顺序便成为辨别萤光标记的新方法：两个目标距离仅 1 纳米左右，但因为发光顺序、萤光颜色不同，在重建过程中能够被电脑清楚区分。

在真实的细胞中，若想以不同嵌合片段（docking strands）标记邻近的相同蛋白（例如Nup96 dimer, CD20 dimer），则多少需要仰赖运气。目前的 RESI 使用随机标记（stochastically labelling），而非直接指定标记种类与位置。

以 RESI 定位核孔复合体的 Nup96 蛋白（图d.），可以达到电子显微镜的解析度（图 b.）。本实验对同一个核孔进行 4 轮标记定位（图d.），每次得到的定位资讯将重建叠合成最终定位图。图片来源：Reinhardt et al. Ångström-resolution fluorescence microscopy. Nature 617, 711–716 （2023）.

定位 Nup96 的实验就是一个例子，荣曼团队的4种嵌合片段中，需要有 2 种分别标记相邻的 Nup96 蛋白，才能够使两个相邻蛋白分别依序发光。荣曼强调，得到理想标记的机率，会随着嵌合片段的种类提升。在荣曼团队的定位实验中，RESI 对 Nup96 的定位达到和扫描式电子显微镜同等精密的解析度。

荣曼认为：“理论上，透过发光顺序的差异，RESI 技术可以分辨无限接近的两点。”

定位次数带来解析度新境界

基于光波绕射的性质，点光源的光线不会透过显微镜聚焦为理想的一点，而是呈现一个立体球状照射范围。这个让科学家困扰一个半世纪的照射范围，就是此光学系统的点扩散函数（PSF, Point Spread Function）。

在显微镜焦平面上，PSF 会形成一个中心最亮、四周渐黯的圆形光斑（艾里斑，Airy Disk），若两个光点的光斑大幅重叠，就会难以辨别。这也就是远场光学显微镜的最大天然障碍：阿贝绕射极限的由来。

包含 PALM, STORM 等超解析技术的单分子定位显微术（SMLM, Single-Molecule Localization Microscopy）也必须考虑 PSF。它们定位解析度（也称定位精准度，σSMLM），接近点扩散函数的标准差（σDiff）除以每次定位侦测光子数（N）的平方根：

σSMLM ≈ σDiff / N1/2

解析度数值愈小，代表辨别极限的距离愈近，定位结果愈清晰。超解析定位技术不断追求的，就是缩小 σSMLM。

在点扩散函数标准差（σDiff）随仪器性能固定的情况下，每次定位侦测的光子数 N 就是定位解析度的主要变数。多数单分子定位技术，都需要设法提升侦测光子数以看得更清晰。

与其他单分子定位术不同的是，RESI 采用的 DNA-PAINT 探针对目标分子反覆结合、脱落，不断有新的萤光探针前仆后继，迅速与目标短暂结合，可以对每个目标累积多次定位。

DNA-PAINT 技术可达到小于绕射极限的解析度，但 10 纳米内的构造依然难以辨识。加上 RESI 以定位顺序进行辅助，可以将解析度提升近百倍，达到 10 埃的尺度。图片出处：S. C. M. Reinhardt et al., Nature 617, 711 （2023）

因此目标的“定位次数”（K）进入解析度数值核心。每个目标定位的解析度由单次定位的点扩散函数标准差（σSMLM），转变为多次放光定位的平均值标准误差（SEM, Standard Error of the Mean），其大小和定位次数（k）的平方根成反比。

SEM≈ σSMLM / k1/2 ≈ （σDiff / N1/2） / k1/2

此时只要提升定位次数（k），就可以得到更精密的定位（σRESI），毋须追求更强或更漫长的萤光来增加每次侦测的光子数（N）。再搭配以定位顺序区分邻近分子，RESI 就能得到近乎无限小的解析度。这种灵活的反覆定位模式，有赖 DNA-PAINT 技术奇特的“不牢固”结合（transient binding）搭配荣曼团队研发的开源影像处理软件Picasso 合力实现。