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登上 CRISPR 浪潮

对分子生物学家而言，CRISPR 是一非常强大的工具，可以用来更了解基因体如何运作，以及探讨更深入的问题。2016年“自然”期刊(Nature )整理出 CRISPR-Cas9 发展的五个方向，及其如何改变科学家们研究的方法。

(一)坏掉的剪刀(BROKEN SCISSORS)

CRISPR-Cas9 系统主要由两个部分组成，一个可以辨识特定基因序列的引导RNA 分子，和一个具有分子剪刀特性的 Cas9 酵素，引导RNA 分子让 Cas9 酵素与特定基因序列结合，进而剪断DNA。此特性提供想要借由破坏特定基因来研究其功能的科学家一个威力强大的工具。同时配合提供特定的修复模版，使基因以不同方式修复，可以让研究者在任何基因体特定位置放入任何一段新序列。

2012年，当大家正致力于利用此工具剪断人类基因时，加州大学旧金山分校系统生物学家Jonathan Weissman 所带领的团队却有不一样的做法: 破坏分子剪刀。Stanley Qi 将 Cas9 酵素加以突变(mutate)(注1)，使其虽然可以结合至引导 RNA 所辨识的基因序列，却失去将其切断的功能，同时诱变的 Cas9 酵素阻挡了其他转录所需的蛋白质与此特定基因结合，形同在不影响与改变DNA 序列的状况下关掉此特定基因的基因表现。科学家不满足止步于此，他们更进一步再将可以活化基因表现的蛋白质接到这被破坏的剪刀 (诱变Cas9 酵素)上，让特定基因表现得以被活化，建立了一套在不影响原DNA 序列状况下，可以自由打开或关闭基因表现的系统。数个实验室团队也陆续发表了更多成果，甚至可在同一实验中调控三个或更多的基因，应用于复杂生物机制的研究。

(二)CRISPR 非遗传性的调控 (CRISPR EPIGENETICS)

从事基因疗法研究的荷兰遗传学家 Marianne Rot，一开始致力于寻找造成疾病的突变基因，但是后来发现更多疾病是来自基因表现受到干扰，而非源于单一的基因突变。她认为最好控制基因活性的方法，就是调控基因表现。组蛋白(histones) 是缠绕包裹DNA 的蛋白质，组蛋白包裹 DNA 的程度会影响到其他到蛋白质靠近DNA的情形，且组蛋白与DNA的结合程度会随着个体发育和环境而改变。科学家发现：从大脑活动到肿瘤生长，都和基因序列以外的调控有关，但是研究的瓶颈在于无法改变特定基因位置的标记。CRISPR-Cas9 技术的出现，让这个研究瓶颈看到解套的曙光。2015年Charles Gersbach 成功地将一个可以将乙酰基接到组蛋白上的酵素接在失去剪断 DNA 功能的 Cas9 酵素上，再借由引导 RNA 将此酵素带至目标基因，进而影响该基因的表现。

(三)CRISPR 破解密码 (CRISPR CODE CRACKING)

超过98%的人类DNA和蛋白质的合成无关，科学家们认为这大多数的DNA 应该也有重要功能，只是我们还不知道。CRISPR-Cas9 技术提供了一个方法来探讨此一问题。利用此技术，科学家们可以针对特定序列，例如做为増强子(enhancer) 或转录出非转译型 RNA 的 DNA 序列去做研究。Farnham 和她的团队发现，原本以为和前列腺癌和大肠癌有关的突变加强子，经由CRISPR-Cas9 删除后，并不影响旁边基因的表现，显示我们原本用来分析加强子强度的方法，并不能反映出真实状况。由遗传学家David Gifford 和Richard Sherwood 领导的研究团队在四万碱基对长的 DNA 序列做一系列的突变，尝试定出影响基因表现的 DNA 序列图谱。不过 CRISPR-Cas9 技术也不是万能的，在此方面的应用有其侷限性，毕竟 Cas9 酵素只能由引导 RNA 带至特定区域，且在靠切割位置处 DNA序列必须有一定碱基对序列共通性，当进行非转译型 DNA的研究时，不能在DNA任何位置任意切割，因为可能会产生各种非预期的影响。最近张锋所带领的团队找到另一群 Cpf1 酵素群，其作用和 Cas9 酵素类似，但是可辨识不一样的DNA序列，或许未来可以发现各种不同酵素，用来切割所有想要研究的基因体位置。

(四)CRISPR 以光来控制基因表现 (CRISPR SEES THE LIGHT)

Gersbach的实验室使用基因编辑技术来探讨细胞命运以及其调控，他们希望能在培养皿里培养组织，用来筛检药物，并测试细胞治疗成效。但是 CRISPR-Cas9 的作用结果是永久性的，与他们需要能够暂时打开或关掉基因表现的期待不合。于是他们加了一个能被蓝光活化的蛋白质到失去切割能力的 Cas9 酵素上：当他们用蓝光照射细胞，特定基因开始表现，关掉蓝光特定基因则停止表现。其他团队也有发展出类似的技术，改以化学物质当作基因表现的开关。

(五)以CRISPR来制造各种生物模型(MODEL CRISPR)

以原有的技术要制造出基因转殖动物来作为研究模型是非常耗时耗费的工程，CRISPR-Cas9 将这以年为单位的过程大幅缩短为一个月内可完成的实验。所以许多之前无法做到的研究，如今都有可能达成，例如从癌症到神经煺化研究，都已采用此一新技术。

一般而言，研究单位会将他们新发展出来的分子工具(Techniques of molecular biology)(注2)或新质体(Plasmid)寄存于非营利事业的Addgene 公司，以提供其他有兴趣的科学家使用。自从2013年初研究人员首度发表他们能以 CRISPR-Cas9 技术切割人类细胞内基因体任何一特定位置后，Addgene 公司的询问电话就没停过，分子生物学家们都急于获得此技术，能够简单且准确地修改编辑几乎所有生物体的基因体。

目前真正革命性的发展正在实验室里展开，CRISPR 提供生物学家所需要的一大特点：特定明确性，可以准确地辨识庞大的基因体裹特 定的序列。而编辑DNA 只是其中一项技能，科学家进一步将此技术做不同的改变，可以将蛋白质送至特定基因体位置作调控，以启动或停止特定基因表现，甚至可以设计整个生物循环，最终了解细胞内的系统和疾病的细节。 毕竟CRISPR-Cas9 只是一项技术，我们现在拥有此一强大的工具，最终仍需回归解决生物问题本身，那才是我们的真正目的。

注1：更改 DNA 序列，重新做出突变的蛋白质。

注2：研究分子生物学所使用的工具或技术，例如分子纯化繁殖(Molecular cloning)、聚合酶连锁反应(Polymerase chain reaction (PCR))、凝胶电泳Gel electrophoresis、南方[氏]印渍术Southern blotting等等。